Fils d'un décorateur de plateau, Dustin Hoffman étudie l'art dramatique à la Pasadena Community Playhouse, puis part à New York suivre les cours du célèbre Lee Strasberg, à l'Actor's Studio. En 1964, il fait ses débuts sur les planches, dans une pièce de Samuel Beckett, En attendant Godot.

Alors qu'il joue Eh ? à Broadway, Mike Nichols le remarque et lui offre le rôle principal du Laureat (1967), qui lui vaut une nomination à l'Oscar du meilleur acteur. Le succès qu'il remporte alors lui permet de profiter des fastes années 70 du cinéma américain, et, variant les registres, de multiplier les tournages de films dont la plupart sont depuis devenus des classiques du 7ème art. Il incarne ainsi Ratso Rizzo dans Macadam cowboy (1969), joue dans Little Big Man (1970), les Chiens de paille (1971) de Sam Peckinpah, Papillon (1973), aux côtés de Steve McQueen, Lenny de Bob Fosse (1974)... Peu après, il se glisse dans la peau du journaliste du Washington Post Carl Bernstein dans Les Hommes du president d'Alan J. Pakula, avant de subir un véritable calvaire entre les mains du dentiste tortionnaire Laurence Olivier, dans le glaçant Marathon man (1976). En 1979, le film de Robert Benton, (1979), lui rapporte son premier Oscar de meilleur acteur.

Travesti en femme pour interpréter le comédien au chômage de Tootsie (1982), l'acteur émeut en autiste prodige chaperonné par Tom Cruise, dans Rain Man (1988). Deux grands succès, qui lui valent une nouvelle nomination à la statuette du meilleur acteur (Tootsie) puis un deuxième Oscar pour Rain Man en 1989. On retrouve dès lors Dustin Hoffman, toujours irréprochable, dans des films moins marquants, comme Hook ou la revanche du Capitaine Crochet de Steven Spielberg (1990), ou Alerte de Wolfgang Petersen (1995), même s'il s'illustre en 1992 dans le satirique Héros malgré lui de Stephen Frears.

Retour à un ton polémique en 1997 avec Mad City de Costa-Gavras, et Des hommes d'influence de Barry Levinson, dans lequel l'acteur incarne un cynique producteur hollywoodien. En 1999, l'acteur endosse la soutane pour le Jeanne d'Arc de Luc Besson, se faisant ensuite plus discret durant quelque temps, avant un retour amorcé en 2003.

Enchaînant les tournages à un rythme de plus en plus soutenu, parfois pour de simples apparitions (Les Désastreuses aventures des orphelins Baudelaire), il campe un directeur de théâtre pince-sans-rire et débonnaire dans Neverland, avant de retrouver la même année Robert De Niro à l'affiche d'une pure comédie, Mon beau-père, mes parents et moi, et de s'adjoindre à l'impressionnant casting du quatrième film de David O. Russell, J'adore Huckabees.